Développement d’une approche originale de cytométrie en flux pour préciser le caractère pathogène des mutants d'ARMC5 (Armadillo Repeat Containing 5) identifiés dans l’hyperplasie macronodulaire bilatérale primitive des surrénales.
A. Vaczlavik*a (Mlle), L. Drougata (Dr), S. Espiarda (Dr), K. Perlemoinea (Mme), B. Ragazzona (Dr), M. Rizk-Rabina (Dr), J. Bertherata (Pr)
a Institut Cochin (U1016 Inserm/UMR8104 CNRS/UMR-S8104), Paris, FRANCE
* anna.vaczlavik@gmail.com
Introduction: Une mutation germinale inactivatrice du gène ARMC5 est retrouvée à l’état hétérozygote chez 25% des patients présentant une hyperplasie macronodulaire bilatérale primitive des surrénales (HMBPS). A ce jour, 69 mutations ont été identifiées (données personnelles et de la littérature). La pathogénicité des mutations faux-sens d’ARMC5 doit être étudiée. Les premières études suggèrent un rôle pro-apoptotique de la protéine ARMC5 sauvage (ARMC5-WT), altéré chez les mutants. Pour quantifier l'apoptose induite par ARMC5-WT et ses variants, une approche de cytométrie en flux a été mise au point qui mesurait, après fixation, la fluorescence émise par un anticorps anti caspase-3, dans une population surexprimant ARMC5. Nous travaillons à une procédure simplifiée sur cellules vivantes.
Méthode: 3 lignées cellulaires -HeLa, HEK, H295R- sont transfectées avec un vecteur d’expression étiqueté GFP (pIRES-EGFP2), permettant la surexpression d’ARMC5-WT ou d’un mutant connu pathogène: p.L548P. Une construction sans ARMC5 est transfectée en contrôle. L’apoptose est étudiée dans les HeLa à 12, 14 et 20h de transfection en utilisant le marqueur membranaire Annexine-V conjugué au fluorochrome Alexa-647mm. Acquisitions sur Accuri-C6.
Résultats: L'apoptose des cellules HeLa surexprimant ARMC5-WT semble être un phénomène précoce, observable dès 14h de transfection et qui n’est pas induit par la surexpression du mutant p.L548P (respectivement 25, 35 et 23% de cellules Annexine-V positives dans les groupes contrôle, ARMC5-WT et ARMC5-muté p.L548P). Ces résultats doivent être confirmés. La procédure est à tester dans les HEK et les H295R.
Perspectives: Ce protocole devrait être appliqué aux mutations faux-sens d’ARMC5 pour préciser leur caractère pathogène.
L’auteur n’a pas transmis de déclaration de conflit d’intérêt.