Résumé
Détermination du statut d’hyperméthylation des corticosurrénalomes par séquençage haut débit
B. De La Villéon*a (Dr), M. Néoub (M.), W. Luscapb (Mme), A. Jouinotb (Dr), F. Letourneurc (M.), K. Perlemoineb (Mme), F. René-Corailb (Mme), B. Doussetd (Pr), S. Gaujouxe (Dr), J. Bertheratf (Pr), G. Assiég (Pr)
a Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS 8104, Université Paris Descartes ; Service de chirurgie digestive et endocrinienne, Hôpital Cochin, Assistance Publique Hôpitaux de Paris ; Service de chirurgie digestive, Hôpital d’Instruction des Armées du Val de Grâc, 75014, FRANCE ; b Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS 8104, Université Paris Descartes, Paris, FRANCE ; c Institut Cochin, plate-forme de séquençage et génomique, Paris, FRANCE ; d Service de chirurgie digestive et endocrine, Hôpital Cochin, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Paris, FRANCE ; e Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS 8104, Université Paris Descartes ; Service de chirurgie digestive et endocrine, Hôpital Cochin, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Paris, FRANCE ; f Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS 8104, Université Paris Descartes; service d'Endocrinologie, Hôpital Cochin, Assistance Publique Hôpitaux de Paris; Centre de Référence des maladies rares de la surrénale, Paris, FRANCE ; g Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS 8104, Université Paris Descartes; service d'Endocrinologie, Hôpital Cochin, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Paris, FRANCE
* bruno.de-la-villeon@inserm.fr
L’hyperméthylation de l’ADN des corticosurrénalomes dans les régions promotrices des gènes (ilôts CpG) est de mauvais pronostic, de même que les mutations de quelques gènes conducteurs.
Objectif : Mesurer la méthylation des îlots CpG par séquençage haut-débit. Ainsi les mutations et l’hyperméthylation seraient étudiés dans une seule expérience de séquençage (prédicteur moléculaire pronostique). Principe général : traitement de l’ADN par bisulfite, puis séquençage ; les cytosines non méthylées deviennent des thymidines, alors que les cytosines méthylées restent des cytosines.
Méthode : Les séquences d’îlots différentiellement méthylés (d’après le méthylome de 45 corticosurrénalomes, Illumina 27k) sont soumises au logiciel MethPrimer, afin d’obtenir des amorces PCR n’amplifiant que l’ADN modifié par bisulfite (bisulfite-spécifique), que l’îlot soit méthylé ou non (méthyl-insensible). L’ADN tumoral est traité par bisulfite (EZ-DNA-Methylation-Gold, Epigenetics-Cie), puis amplifié (TaqGold, LifeTechnologies). Le séquençage haut débit par PGM IonTorrent (LifeTechnologies) est aligné par un programme spécifique (code R).
Résultats : 35/55 îlots les plus significativement hyperméthylés (d’après le méthylome) permettent le dessin de couples d’amorces PCR bisulfite-spécifiques et methyl-insensibles. 8/35 de ces îlots ont pu être amplifiés depuis un ADN-test traité par bisulfite. Le séquençage a généré une profondeur moyenne de 4000X, aligné par notre programme spécifique. Pour chaque CpG, les C (cytosines méthylées) et les T (cytosines non méthylées) ont été comptées. L’efficacité de l’approche est confirmée sur 6 corticosurrénalomes de méthylation variable.
Conclusion : Le statut de méthylation d’une tumeur peut être déterminé par séquençage ciblé direct de l’ADN traité par bisulfite.
L’auteur n’a pas transmis de déclaration de conflit d’intérêt.